中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）非常容易受到損害時(shí)，當(dāng)其血液供應(yīng)會(huì)受到損害。因此CNS具有許多控制系統(tǒng)以確保充足的血液供應(yīng)。去甲腎上腺素（NA）和多巴胺產(chǎn)生廣泛的血管收縮，從而有效地節(jié)省了血液用于通過(guò)神經(jīng)血管擴(kuò)張耦合局部活性區(qū)域。雖然單獨(dú)AADC活性不足以對(duì)5-HT的內(nèi)源性合成（實(shí)際上血管缺乏5-HT SCI后14，23，24），AADC可以直接合成痕量胺，例如色胺和酪胺，來(lái)自色氨酸和酪氨酸等氨基酸。中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS血流被認(rèn)為是由小動(dòng)脈的平滑肌細(xì)胞（SMC）來(lái)控制該緊勒響應(yīng)于血管活性物質(zhì)，包括中央衍生的5-HT和NA作用于5-HT 1和α2-腎上腺素能受體，通過(guò)發(fā)生在周邊類(lèi)似機(jī)制。小動(dòng)脈分支形成沒(méi)有SMC的小毛細(xì)血管，但與環(huán)繞CNS毛細(xì)血管的稀疏間隔的周細(xì)胞相關(guān)。

雖然周細(xì)胞具有不同的功能，包括脊髓損傷后促進(jìn)疤痕形成，許多周細(xì)胞是收縮，含平滑肌α肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和收縮響應(yīng)于單胺。事實(shí)上，周細(xì)胞最近已顯示出在兩個(gè)控制正常CNS血流中起主要作用，并缺血性中風(fēng)的響應(yīng)。研究人員發(fā)現(xiàn)到當(dāng)SADC后毛細(xì)血管中的AADC上調(diào)時(shí)，其在周細(xì)胞中的表達(dá)最為強(qiáng)烈。因此本論文研究人員通過(guò)微電極探索了周細(xì)胞是否通過(guò)合成取代丟失的單胺的TA來(lái)在SCI后調(diào)節(jié)毛細(xì)血管張力和血流中起特殊作用。

操作步驟

unisense光學(xué)氧電極測(cè)量了正常無(wú)損傷和SCI大鼠體內(nèi)的氧濃度。老鼠首先進(jìn)行麻醉，椎板切除術(shù)和立體定向穩(wěn)定與上述脊髓血管成像的設(shè)置相似。用光學(xué)氧微電極傳感器（Unisense）測(cè)量老鼠脊髓液中氧氣的分壓（pO2），該傳感器尖端直徑為50μm，并涂有熒光團(tuán)，當(dāng)用610 nm紅光激發(fā)時(shí)，發(fā)出780 nm紅外光其強(qiáng)度與附近的氧氣濃度成比例地變化，從而淬滅了該光（其中1μM O2=0.62 mmHg pO 2;）。unisense克拉克型氧氣為微電極傳感器安裝在微操縱器上，以將微電極尖端垂直推進(jìn)到脊髓背側(cè)表面。尖端穿透脊膜，然后深入到背角和腹角的灰質(zhì)中，或者使脊膜凹陷而不會(huì)穿透背角（<200μm）。兩種氧分壓的測(cè)試方法均獲得相似的pO2測(cè)量值。采用微電極尖端穿透脊膜方法造成較小的局部損壞，因此是較好的原位測(cè)試?yán)鲜蠹顾鑳?nèi)氧分壓的方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

廣泛釋放的血管收縮（血管緊張）是由腦干神經(jīng)元細(xì)胞釋放的單胺5-羥色胺和去甲腎上腺素引起的，而局部血管的擴(kuò)張是由谷氨酸能神經(jīng)元的活性引起的。檢測(cè)了血管緊張度如何適應(yīng)大鼠脊髓損傷（SCI）后神經(jīng)元衍生的單胺的丟失。研究發(fā)現(xiàn)在實(shí)施脊髓損傷數(shù)月后，由于單胺受體（5-HT 1的反常過(guò)量活性）損傷部位下方的脊髓處于慢性缺氧狀態(tài)。在周皮細(xì)胞上，盡管沒(méi)有單胺，這種單胺受體活性導(dǎo)致周細(xì)胞局部收縮毛細(xì)血管，從而將血流減少至缺血水平。在不存在單胺的情況下，受體活化是由異位表達(dá)芳香族-1-氨基酸脫羧酶（AADC）的周細(xì)胞產(chǎn)生痕量胺（例如色胺）造成的，后者直接從飲食氨基酸（例如作為色氨酸）。抑制單胺受體或AADC，甚至增加吸入氧，可使脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能得到顯著緩解。

圖1、脊髓損傷后痕量胺會(huì)收縮毛細(xì)血管。（a）脊髓血管系統(tǒng)示意圖。（b）免疫標(biāo)記脊髓毛細(xì)血管（v）和尾巴至SCI部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，a）上的周皮細(xì)胞（NG2，p）。（c）微分干涉顯微鏡(DIC)設(shè)置的示意圖，用于在脊髓損傷后對(duì)臍帶皮層表面以下的毛細(xì)血管成像。（d）頂部，慢性IC骨橫斷的尾椎脊髓毛細(xì)血管的DIC圖像，RBC（R）和內(nèi)腔偽彩色為紅色（箭頭指向內(nèi)皮）。底部，應(yīng)用色氨酸（30μM）會(huì)引起與周細(xì)胞（p）相鄰的局部性局部血管收縮（白色箭頭；開(kāi)始于應(yīng)用后1分鐘），但在缺乏周細(xì)胞的區(qū)域中則不會(huì)（黑色箭頭）。（e）與d相同，但在色氨酸之前使用AADC抑制劑（NSD1015[NSD]；300μM），以防止產(chǎn)生色胺。（f）色胺的應(yīng)用模仿了色氨酸誘導(dǎo)的血管收縮（d），與周細(xì)胞相鄰（綠色輪廓）。（g）色氨酸誘導(dǎo)的收縮（頂部，箭頭處）被5-HT 1B受體拮抗劑GR127935（3μM；底部）逆轉(zhuǎn)。（h）正常大鼠的毛細(xì)血管（上），缺乏色氨酸引起的收縮（下）。

圖2、ACI，痕量胺和5-HT 1B受體在SCI后在周細(xì)胞中共表達(dá)。（a）頂部，在慢性脊髓橫斷尾段的脊髓橫切面用AADC抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記（黑色，DAB，上圖），表明AADC在毛細(xì)血管上廣泛表達(dá)（v），但在動(dòng)脈上卻不表達(dá)（a）。底部，在毛細(xì)管的縱向切片中顯示AADC（紅色）和CD13（綠色，周細(xì)胞標(biāo)記）的免疫熒光，顯示AADC和CD13在周細(xì)胞中的唯一共定位（p；黃色）。（b）左圖為內(nèi)源性色胺（黑色）尾部損傷部位的DAB免疫標(biāo)記，顯示毛細(xì)血管（v）的周細(xì)胞（箭頭）尤其是體細(xì)胞中的色胺密集染色。插圖顯示了較高的毛細(xì)管橫截面放大圖（比例尺，10μm），表明周細(xì)胞（p）細(xì)胞體和過(guò)程對(duì)色胺具有染色作用（箭頭），而內(nèi)皮細(xì)胞（e）沒(méi)有（藍(lán)，甲酚-內(nèi)皮細(xì)胞核的紫色染色）。右圖為色胺（紅色）和CD13（綠色）的免疫熒光染色進(jìn)一步顯示了周細(xì)胞中的色胺染色。（C）在用5-HTP（30 mg/kg，腹腔注射，固定前25分鐘）預(yù)處理后，對(duì)AADC產(chǎn)品5-HT和尾部橫斷損傷的尾周細(xì)胞標(biāo)記NG2進(jìn)行免疫標(biāo)記。箭頭，NG2標(biāo)記的周細(xì)胞中的5-HT染色。（d）該AADC產(chǎn)品5-HT（紅色）顯示密集堆積在周細(xì)胞細(xì)胞體內(nèi)，并標(biāo)記有AADC的過(guò)程（綠色；箭頭）。（e）SCI后周細(xì)胞對(duì)毛細(xì)管的作用示意圖，顯示色氨酸（紅色）從血液擴(kuò)散到周細(xì)胞中，AADC合成色胺（黃色），色胺對(duì)附近5HT 1B受體（藍(lán)色）的作用以收縮毛細(xì)血管。（f）如面板c和d所示對(duì)5-HT進(jìn)行免疫標(biāo)記，但未進(jìn)行5-HTP預(yù)處理。（g）對(duì)損傷部位尾端的5-HT 1B受體和NG2進(jìn)行免疫標(biāo)記。

圖3、慢性脊髓損傷后血流不足和缺氧。（a）在心內(nèi)注射亞甲藍(lán)染料（20％于鹽水中）之前和之后（20和40 s），正常和慢性脊髓大鼠的骨和腰椎脊髓背脈管系統(tǒng)的體內(nèi)圖像。（b）在受傷和正常的未受傷大鼠的（尾至損傷）或腰部（延髓）的灌注時(shí)間，并隨5-HT 1B拮抗劑GR127935（GR，30μM局部應(yīng)用于尾線）發(fā)生變化或硝酸鈉；n=每組5只鼠，以箱形圖表示。（c）體內(nèi)的雙光子顯微圖像注射FITC-右旋糖酐后spin骨脊髓血管尾部至損傷部位（iv）。箭頭指示所成像的脊髓下脊髓毛細(xì)血管的位置。計(jì)算RBC流量的指示毛細(xì)管的左下方，較高的放大倍率和較亮的視圖。右下圖是慢性脊髓大鼠未經(jīng)治療和經(jīng)NSD1015（NSD）治療的脊髓（局部給藥3 mM）的組毛細(xì)血管RBC流速的方框圖，每組n=5。（d）脊髓中體內(nèi)氧氣測(cè)量（pO 2）的示意圖。（e）相比于SCI的延髓緣或正常未受傷大鼠，尾部至慢性SCI的低pO 2（缺氧，紅色），以及pO 2的變化擴(kuò)張與NSD1015或容器之后GR127935（GR，局部30μM），或瞬時(shí)高?2呼吸（95％氧氣2，5％CO2，1分鐘）。（f）在用瞬時(shí)氧氣（95％持續(xù)1分鐘;在10-20分鐘測(cè)量），GR127935，RX821002（RX;5μM局部用藥）之前和之后未受傷（正常）和受傷大鼠中pO 2的箱形圖NSD1015（NS）;每個(gè)方法中n=5-20，如方法中所述。藥物作用在數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到峰值，并持續(xù)10-90分鐘（記錄峰值）。氧分壓2值是指從L4–L6（對(duì)受傷或正常腰椎）到S2–S4，Ca1（對(duì)損傷或正常aud骨的尾椎）脊段的平均值。*P<0.05，相對(duì)于治療前對(duì)照（f）或正常組織（b）有顯著差異。

圖4、神經(jīng)血管耦合尾至脊髓損傷。簡(jiǎn)短的機(jī)械刺激尾巴(1秒光沿尾巴摩擦，在箭頭處)提供感覺(jué)輸入到骶脊髓產(chǎn)生，慢性脊髓大鼠的骶管尾部氧合延長(zhǎng)至橫斷(S2橫斷，傷后2個(gè)月)。光學(xué)氧氣微電極(pO2)由背部的光學(xué)傳感器(optode)測(cè)量S4骶脊髓角。這種氧氣的持續(xù)增加反映了經(jīng)典神經(jīng)血管耦合，通過(guò)神經(jīng)元活動(dòng)擴(kuò)張血管并增加氧合。慢性脊髓大鼠明顯的神經(jīng)血管耦合可能有助于解釋短暫吸入強(qiáng)化氧后觀察到的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)(EMG)的延長(zhǎng)增加。

圖5、老鼠脊髓損傷（SCI）后低氧、高碳酸或高氧呼吸后，脊髓脊髓的氧合反彈增加。a)用光學(xué)氧傳感器測(cè)量脊髓中氧分壓(pO2)，慢性脊髓大鼠脊髓的尾部(S2斷面，傷后4個(gè)月)。b)在基線條件下，脊髓是缺氧的。短暫的低氧呼吸(1分鐘呼吸10.5%的氧氣，而不是通常的21%的空氣)引起pO2的立即下降(在黃條處)，可立即引起休克，進(jìn)一步增加脊髓缺氧。隨后pO2增加持續(xù)15-20分鐘，而其他地方的pO2迅速恢復(fù)正常。各組分別為pO2前期(紅色、綠色)和15分鐘后的短暫缺氧(n=7)，高碳酸血癥(30 s呼吸10%CO2空氣，n=5)，或高氧(1 min 100%O2,n=7)呼吸，隨著所有治療的增加，pO2在脊髓尾側(cè)逐漸增加。

結(jié)論與展望

本論文探索了周細(xì)胞是否通過(guò)合成取代丟失的單胺的TA來(lái)在SCI后調(diào)節(jié)毛細(xì)血管張力和血流中起特殊作用。研究結(jié)果表明了幾個(gè)新的概念，這些新概念從根本上改變了脊髓損傷后對(duì)脊髓功能和康復(fù)的理解。脊髓損傷后，周細(xì)胞在調(diào)節(jié)毛細(xì)血管張力和脊髓血流中起主要作用；SCI導(dǎo)致毛細(xì)血管過(guò)度緊張，血液流動(dòng)不良和缺氧的慢性狀態(tài)。研究人員發(fā)現(xiàn)慢性脊髓缺氧與臨床相關(guān)的部分脊髓損傷（挫傷）有關(guān)，并且通過(guò)擴(kuò)張血管的干預(yù)措施（例如，AADC抑制劑）可以實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能的長(zhǎng)期改善。在實(shí)施脊髓損傷數(shù)月后，由于單胺受體（5-HT 1的反常過(guò)量活性）損傷部位下方的脊髓處于慢性缺氧狀態(tài)。在周皮細(xì)胞上，盡管沒(méi)有單胺，這種單胺受體活性導(dǎo)致周細(xì)胞局部收縮毛細(xì)血管，從而將血流減少至缺血水平。在不存在單胺的情況下，受體活化是由異位表達(dá)芳香族-1-氨基酸脫羧酶（AADC）的周細(xì)胞產(chǎn)生痕量胺（例如色胺）造成的，后者直接從飲食氨基酸獲得。抑制單胺受體或AADC，甚至增加吸入氧，可使脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能得到顯著緩解。上述這些研究結(jié)果表明，減輕慢性缺氧是一種有希望的SCI康復(fù)方法。在對(duì)老鼠脊髓液內(nèi)的原位氧分壓測(cè)試采用了unisense光學(xué)氧電極測(cè)試完成的。由于unisense微電極尖端穿透脊膜方法造成較小的局部損壞，因此是一種較好的原位測(cè)試?yán)鲜蠹顾鑳?nèi)氧分壓的方法，被醫(yī)學(xué)研究人員廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織內(nèi)的氧分壓的原位測(cè)試。