本文提出了一種多管離子選擇性微電極對(duì)作物中硝酸根和銨根離子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的方法，并在典型設(shè)施栽培作物番茄的含氮量檢測(cè)中進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)了番茄含氮量的實(shí)時(shí)、快速、準(zhǔn)確和非破壞活體測(cè)量。

1、材料與方法

1.1儀器和測(cè)試方法

微電極信號(hào)放大器使用MultiClamp 700B膜片鉗放大器(AXON公司美國(guó))，工作于I=0模式；數(shù)據(jù)記錄采用pCLAMP10軟件；微電極夾持和定位采用MP-285微操縱器(SUTTER公司，美國(guó))。

參比電極選用Ag/AgCl電極。硝酸根離子濃度測(cè)量電池為：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl和50mM KNO3的混合溶液|硝酸根離子敏感膜‖待測(cè)溶液‖Ag+|Ag(+)。

銨根離子濃度測(cè)量電池為：(-)Ag|AgCl(s)|50mM KCl溶液|銨根離子敏感膜‖待測(cè)溶液‖Ag+|Ag(+)。所有測(cè)量都在室溫(20～25℃)下的法拉第屏蔽網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行。

1.2多管離子選擇性微電極的制備

多管離子選擇性微電極的制備包括敏感劑的配制、電極拉制、硅烷化，以及敏感劑、電極內(nèi)充液的充灌等。

本文設(shè)計(jì)的多管離子選擇性微電極由粘結(jié)在一起的3根軸向平行的微玻璃管組成。微玻璃管經(jīng)拉制后，在其尖端分別灌充硝酸根、銨根離子敏感劑，然后分別灌入硝酸根離子、銨根離子、參比的內(nèi)充液，每種內(nèi)充液中分別插入1根信號(hào)線引出信號(hào)，用密封膠在微玻璃管的尾部進(jìn)行密封，如圖1所示。

1.硝酸根離子敏感劑2.銨根離子敏感劑3.多管微玻璃管

1.2.1敏感劑的篩選

對(duì)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上已有的硝酸根離子、銨根離子敏感劑或離子敏感劑配方進(jìn)行篩選，根據(jù)離子選擇性、斜率、響應(yīng)時(shí)間、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性等指標(biāo)確定最適宜的離子選擇性敏感膜。

從已公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)中選擇了5種硝酸根離子敏感劑配方和6種銨根離子敏感劑配方，分別用A1-A5和B1-B5表示。其中，配方A1為Nitrate ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美國(guó))；配方B1為Ammonium ionophore I-cocktail A(Sigma-Aldrich，美國(guó))。配方A2-A5組成如表1所示，配方B2-B6組成如表2所示。

1.2.2電極拉制

采用PMP107型可編程多管拉制儀(PMP-107，美國(guó))的標(biāo)準(zhǔn)3管拉制程序，將1根3管玻璃管(Hilgenberg，德國(guó))拉制成兩根尖端直徑為微米級(jí)的多管微電極。

表1硝酸根敏感劑配方

表2銨根根敏感劑配方

1.2.3微電極硅烷化

將拉制好的多管微電極置于精密鼓風(fēng)干燥箱(BPG-9040A，中國(guó))中，150℃下烘烤1h，除去殘存在微電極內(nèi)的水蒸氣和雜質(zhì)；將多管微電極放置在帶蓋的玻璃器皿中，放入3mL 5%的二甲基二氯硅烷(國(guó)藥集團(tuán)，上海)，使多管微電極浸泡30min，然后在150℃下繼續(xù)烘烤，使二甲基二氯硅烷的蒸氣進(jìn)入和充分附在微電極的尖端，形成一層疏水層，以利于硝酸根和銨根離子敏感膜的形成和作用。硅烷化后，將去蓋的玻璃器皿在150℃下烘烤，使過(guò)量的二甲基二氯硅烷蒸發(fā)掉。

1.2.4微電極的充灌

使用微量進(jìn)樣針將硝酸根離子敏感劑、銨根離子敏感劑從電極尾端緩慢推入微電極尖端;在顯微鏡下觀察微電極內(nèi)是否有氣泡,若存在氣泡，須將微電極尖端朝下放置一段時(shí)間，直至氣泡完全從微電極中消失;然后在微電極管內(nèi)分別充入相應(yīng)的硝酸根離子內(nèi)充液及銨根離子內(nèi)充液。

1.3電極的標(biāo)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線法是離子選擇性微電極最常用的一種分析方法。將充灌好的多離子選擇性微電極分別放在配制的0.1M、0.01M、1.0mM、0.1mM、0.001mM的硝酸根離子和銨根離子標(biāo)準(zhǔn)溶液中，分別測(cè)定其電位，用以評(píng)價(jià)電極的響應(yīng)范圍、檢測(cè)下限及斜率等性能指標(biāo)。

2、結(jié)果與分析

2.1多管離子選擇性微電極的響應(yīng)參數(shù)

測(cè)定了用不同離子敏感劑或離子敏感劑配方制成的離子選擇性微電極，硝酸根離子選擇性微電極在一系列硝酸根離子濃度為0.1M～0.001mM的標(biāo)定溶液的標(biāo)定曲線，如圖2所示；響應(yīng)參數(shù)如表3所示。銨根離子選擇性微電極在一系列銨根離子濃度為0.1M～0.001mM的標(biāo)定溶液的標(biāo)定曲線，如圖3所示；響應(yīng)參數(shù)如表4所示。

從表3中對(duì)比可得，配方A1制成的敏感膜性能優(yōu)于其它配方。因此，選取配方A1作為本研究的硝酸根離子敏感劑。

配方編號(hào)響應(yīng)范圍/M斜率/mV·(log[NH4+])-1檢測(cè)下限/M響應(yīng)時(shí)間/sB110-1～10-558.62010-58B210-1～10-451.39310-415B310-1～10-439.94710-450B410-1～10-433.50710-460B510-1～10-428.62310-475

從表4中對(duì)比可得，配方B1制成的敏感膜性能優(yōu)于其它配方。因此，選取配方B1作為本研究的銨根離子敏感劑。

2.2多管離子選擇性微電極的離子選擇性

采用混合溶液法測(cè)定了多管離子選擇性微電極的選擇性，如表5所示。表5中所有的陰離子均采用鈉鹽，所有的陽(yáng)離子均采用氯化物。

從表5中可以發(fā)現(xiàn):Br-對(duì)NO3-選擇性微電極有一定干擾，但番茄作物中Br-含量較少，其影響可以忽略不計(jì);K+對(duì)NH4+選擇性微電極有輕微干擾。

表5多管離子選擇性微電極的選擇性

2.3多管離子選擇性微電極的穩(wěn)定性

研制的多管離子選擇性微電極，在室溫下(溫度波動(dòng)在±2℃內(nèi))連續(xù)測(cè)量10h，當(dāng)NO3-濃度為10-2M時(shí)候，電極電位波動(dòng)在±1.5mV，相對(duì)誤差為1.3%。

2.4多管離子選擇性微電極的重現(xiàn)性

在室溫下(溫度波動(dòng)±1℃)使用同一支多管離子選擇性微電極對(duì)硝酸根、銨根離子濃度均為1mM的被測(cè)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，每天測(cè)試3次，每次連續(xù)測(cè)量4h，測(cè)試結(jié)果如表6所示。

表6微電極的重現(xiàn)性

表6中的標(biāo)準(zhǔn)偏差值較小，說(shuō)明研制的多管離子選擇性微電極重現(xiàn)性較好。

2.5番茄氮素營(yíng)養(yǎng)檢測(cè)

采用所研制的多管離子選擇性微電極對(duì)其設(shè)施栽培番茄葉片樣本中NO3-及NH4+濃度進(jìn)行測(cè)試，測(cè)得的NO3-和NH4+的離子敏感電極信號(hào)穩(wěn)定后，其電壓值分別為-103.84 mV和-16.53mV，如圖4所示。根據(jù)NO3-和NH4+選擇性微電極的標(biāo)定曲線，計(jì)算出番茄葉片內(nèi)NO3-和NH4+的濃度分別為0.20mmol/L和0.51mmol/L，轉(zhuǎn)換成總氮質(zhì)量比濃度，得番茄葉片中含氮量為25.00mg/g。

圖4多管離子選擇性微電極信號(hào)記錄圖

對(duì)番茄葉片樣本的總氮量進(jìn)行檢測(cè)，由AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀(SEAL，德國(guó))測(cè)得番茄葉片樣本中含氮量為26.03mg/g。

與采用AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)得的含氮量相比，采用多管離子選擇性微電極測(cè)得的番茄葉片中含氮量絕對(duì)誤差為1.03mg/g,相對(duì)誤差為3.96%。

結(jié)論：篩選出的硝酸根離子選擇性微電極和銨根離子選擇性微電極組成的多管離子選擇性微電極，有良好的離子選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。與采用AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀測(cè)量番茄葉片的含氮量相比，采用該方法測(cè)量的絕對(duì)誤差為1.03mg/g,相對(duì)誤差為3.96%。因此，采用該方法制作的多管離子選擇性微電極檢測(cè)番茄葉片中的含氮量是可行的。