研究簡介:細(xì)胞衰老加劇是導(dǎo)致衰老和多種疾病的主要原因之一。衰老的特點(diǎn)是持續(xù)的細(xì)胞周期停滯和各種細(xì)胞獨(dú)特的促炎分泌表型，這創(chuàng)造了衰老微環(huán)境（SME），在負(fù)反饋循環(huán)中驅(qū)動組織功能障礙惡化，從而降低自我修復(fù)能力組織。氫分子(H2)由于其抗氧化能力，可以選擇性清除羥基等高氧化性/毒性自由基，已被證明是一種新興的安全、有效和廣譜抗炎劑。由于衰老與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，H2被發(fā)現(xiàn)對許多細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成纖維細(xì)胞）和內(nèi)皮組織具有抗衰老作用，且無明顯毒副作用，表現(xiàn)出良好的抗衰老選擇性和普適性。然而，衰老/損傷疊加衰老比個體衰老或損傷引起的衰老嚴(yán)重得多，并且H2對衰老骨損傷引起的衰老/損傷并發(fā)衰老的影響目前尚不清楚。此外，此前報(bào)道的H2抗衰老給藥途徑主要是口服富氫水和吸入氫氣，無法長期達(dá)到高H2濃度。由于H2的溶解度低且分散度高，其在病變部位的持續(xù)時(shí)間較長，導(dǎo)致抗衰老功效有限。

本研究首先揭示了持續(xù)H2供應(yīng)對于重塑老化骨中SME的必要性，然后設(shè)計(jì)了一種聚羥基脂肪酸酯（PHA）封裝的CaSi2納米粒子（CSN）負(fù)載介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持續(xù)（長達(dá)1周）釋放高劑量H 2（911 mL/g CSN），實(shí)現(xiàn)有效重塑SME并增強(qiáng)受損老化骨骼的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)了SME重塑修復(fù)損傷老化骨的機(jī)制，持續(xù)的H 2治療普遍減輕了SME中的氧化應(yīng)激，并通過抗炎途徑有效地重塑了各種衰老細(xì)胞的SASP，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞復(fù)極化至抗炎表型、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集、血管生成和成骨，支持受損的老化骨修復(fù)。

Unisense微呼吸系統(tǒng)的應(yīng)用

通過氫氣電極（Unisense，丹麥）檢測CSN和CSN PHA-MBG在PBS緩沖液（pH 7.4）中的氫氣釋放行為，并根據(jù)預(yù)先建立的氫氣濃度計(jì)算氫氣濃度氫溶解水梯度濃度的氫校準(zhǔn)曲線。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

揭示了持續(xù)H2供應(yīng)對于重塑老化骨中SME的必要性，然后設(shè)計(jì)了一種聚羥基脂肪酸酯（PHA）封裝的CaSi 2納米粒子（CSN）負(fù)載介孔生物活性玻璃（MBG）支架（CSN PHA-MBG）用于局部持續(xù)（長達(dá)1周）釋放高劑量H2（911 mL/g CSN），實(shí)現(xiàn)有效重塑SME并增強(qiáng)受損老化骨骼的修復(fù)。CSN的儲氫能力比水高4.6×104倍，CSN PHA的持續(xù)釋氫能力（約1周）遠(yuǎn)高于富氫水（約30分鐘）。發(fā)現(xiàn)了SME重塑修復(fù)損傷老化骨的機(jī)制，持續(xù)的H2治療普遍減輕了SME中的氧化應(yīng)激，并通過抗炎途徑有效地重塑了各種衰老細(xì)胞的SASP，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞復(fù)極化至抗炎表型、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞募集、血管生成和成骨，支持受損的老化骨修復(fù)。

圖1、可持續(xù)H2處理衰老骨中的各種衰老細(xì)胞的體外抗炎和抗衰老行為。(a)測試持續(xù)H2治療對從老化骨骼中收集的BMSC、巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞的影響的示意圖;（b）代表性衰老生物標(biāo)志物的測量（ROS、HO-1、p16、p21、Ki67、BMSC、巨噬細(xì)胞和骨細(xì)胞中的γ-H2A.X、TAF、SA-β-gal、IL-6和IL-1β）在有或沒有H2的情況下持續(xù)培養(yǎng)7天;(c)說明細(xì)胞衰老特征以及H2對SME調(diào)節(jié)的抗衰老、抗炎和再生保護(hù)作用。

圖2、CSN和CSN PHA-MBG支架的結(jié)構(gòu)和釋氫行為。CSN的代表性SEM(a)和元素映射(b)圖像、CSN和CaSi 2原材料的XRD圖譜(c)、CSN PHA的代表性SEM和元素映射圖像(d)、SEM圖像不同放大倍數(shù)的CSN PHA-MBG支架的H 2釋放曲線，以及CSN含量為1 mg·mL?1產(chǎn)率。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果相似。

圖3、支架治療7天后老化骨缺損部位的SASP成分分析。(a)細(xì)胞因子陣列分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖；(b)代表性小鼠細(xì)胞因子陣列圖像(c)相應(yīng)的定量（n=2個生物學(xué)獨(dú)立樣本）(d)通過ELISA測量的細(xì)胞因子水平。

圖4、使用CSN PHA-MBG支架修復(fù)老化骨缺損的結(jié)果。（a）用鈣黃綠素（綠色）和茜素紅S(紅色)對骨形成進(jìn)行連續(xù)熒光標(biāo)記；（b）并對礦物質(zhì)沉積率進(jìn)行相應(yīng)的定量分析(n=8個生物學(xué)獨(dú)立樣本),(c)對新組織進(jìn)行組織學(xué)檢查第14天和第28天指定治療后的老化骨缺損部位，(d)對照、PHA-MBG或CSN PHA-MBG治療后第28天的新組織代表性SRμCT圖像；(e)相應(yīng)的BV/TV量化、(f)Tb.Th和(g)Tb.N（n=3個生物學(xué)獨(dú)立樣本）；(h)代表性免疫染色圖像以及(i)p16（紅色）、Vpp3（紅色）的相應(yīng)量化數(shù)據(jù)）。(j)指定治療后第28天新組織中的Osterix（白色）和Emcn（綠色）表達(dá)（n=4個生物學(xué)獨(dú)立樣本,說明氫介導(dǎo)的損傷老化骨再生機(jī)制，其中局部和持續(xù)的H<b0>CSN PHA-MBG支架的釋放通過誘導(dǎo)有效的抗炎（巨噬細(xì)胞極化）和普遍的抗衰老來重塑SME，從而促進(jìn)MSC的募集并保留其再生能力。

圖5、PBS中CSN PHA-MBG和CSN累積H2釋放量的定量。CSN PHA-MBG和CSN均含有等量的CSN(1mg mL-1)1).由于H2在PBS中的溶解度低，24 h內(nèi)快速從CSN中釋放出來，因此H2從溶液中溢出，導(dǎo)致H2的累積量有顯著差異。在CSN PHA-MBG和CSN之間釋放。

結(jié)論與展望

衰老微環(huán)境會導(dǎo)致持續(xù)炎癥和內(nèi)在再生能力喪失，是老年人有效組織修復(fù)的主要障礙。在這項(xiàng)工作中，研究人員發(fā)現(xiàn)局部H2供應(yīng)可以通過骨骼成熟骨的各種衰老細(xì)胞的抗炎和抗衰老作用來重塑衰老微環(huán)境。研究人員構(gòu)建了一種H 2釋放支架，通過電噴霧聚羥基脂肪酸酯封裝的CaSi 2，將納米顆粒附著到介孔生物活性玻璃上可以釋放高劑量的H2（911 mL/g，長達(dá)1周）。在老年小鼠模型中展示了微環(huán)境的有效重塑和臨界尺寸骨缺損的增強(qiáng)修復(fù)。從機(jī)制上講，本研究揭示了局部H2釋放通過衰老巨噬細(xì)胞復(fù)極化和分泌組變化將微環(huán)境從促炎癥改變?yōu)榭寡装Y。相關(guān)研究結(jié)果還表明，H2可以減輕衰老/損傷疊加衰老的進(jìn)展，促進(jìn)內(nèi)源細(xì)胞的募集并保留其再生能力，從而創(chuàng)造一個能夠支持骨缺損再生的促再生微環(huán)境。研究關(guān)于局部H2釋放策略為骨再生提供了一種有前景的抗衰老方法。